Десорбционные методы ионизации в масс-спектрометрии

Десорбционные методы ионизации в масс-спектрометрии — группа методов ионизации в масс-спектрометрии, для которых процессы десорбции твердого анализируемого вещества и его ионизации практически неотделимы во времени.

Наиболее полное развитие получили следующие методы:

• (1) бомбардировка быстрыми атомами (ББА) ― Fast Atom Bombardment (FAB);
• (2) масс-спектрометрия вторичных ионов с жидкой матрицей (ВИМС) ― Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry (LSIMS);
• (3) матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ) ― Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI);
• (4) плазменная десорбция (ПД) ― Plasma Desorption (PD).

В течение последних двух-трёх десятилетий значительное внимание уделялось созданию принципиально новых методов получения в газовой фазе ионов соединений, ограниченная летучесть (или полное её отсутствие) которых не позволяет воспользоваться традиционными подходами. К таким классам относятся различные высокомолекулярные молекулы, биоорганические объекты, всевозможные термолабильные органические и металлоорганические соединения. Реальным прорывом в этой области послужило появление методов ионизации, при которых десорбция и ионизация вещества осуществляется путём бомбардировки (облучения) их ионами, фотонами или нейтральными частицами.

В конце 1970-х годов Макфарлейном (англ. Macfarlane) и сотр.^[1] был разработан метод ионизации биомолекул быстрыми продуктами деления ²⁵²Cf — метод плазменной десорбции (ПД). Тогда впервые была показана возможность масс-спектрометрии в определении точных молекулярных масс для нелетучих соединений, ранее недоступных для анализа методами электронной и химической ионизации. Чуть позднее Беннингховен (англ. Benninghoven) и сотр.^[2] стали использовать для бомбардировки ионы Ar⁺, что послужило началом развития метода ВИМС. В начале 1980-х годов в работах Барбера (англ. Barber) и сотр.^[3] был представлен метод ББА инертного газа. В это же время Сурман (англ. Surman) и Викерман (англ. Vickerman)^[4] выдвинули идею использования жидкой матрицы, которая впоследствии явилась основой для методики анализа различных сложных органических соединений. Так, уже к началу 1980-х годов было показано, что с помощью метода ББА в жидкой матрице в сочетании с масс анализатором с секторным магнитным полем можно изучать молекулы с массами до 20 кДа.

В середине 1980-х годов были предложены различные идеи использования матрицы, когда десорбция/ионизация вещества индуцировалась импульсным лазерным излучением. В 1985 году методика на основе использования мелкодисперсного порошка кобальта для поглощения излучения лазера в глицериновом растворе была предложена Танаке (англ. Tanaka).^[5] Благодаря этой методике были впервые получены молекулярные ионы с массами более чем в 100 кДа. В 2002 году Коити Танака, наряду с Джоном Феном (метод ионизации при электрораспылении), была присуждена Нобелевская премия за вклад в развитие «методов мягкой десорбционной ионизации для масс-спектрального анализа биологических макромолекул».

Карас (англ. Karas) и Гилленкамп (англ. Hillenkamp)^[6] предложили применять в качестве матрицы молекулы органических веществ небольших размеров, обладающие высокими абсорбционными свойствами при длине волны лазерного излучения. Это легло в основу метода МАЛДИ. Метод МАЛДИ открыл более широкие возможности масс-спектрометрии в исследовании таких биомолекул, как пептиды, белки, олигонуклеотиды, полисахариды и др. Диапазон масс молекул, которые можно изучать этим методом, практически неограничен: известны случаи, когда в спектрах наблюдали ионы с массами более чем 1000 кДа.

К настоящему времени МАЛДИ масс-спектрометрия существенно потеснила все остальные десорбционные методы. Современные масс спектрометры МАЛДИ являются более коммерчески доступными и встречаются в очень большом числе лабораторий всего мира. Во многом благодаря своей универсальности и простоте в выполнении экспериментов МАЛДИ остается одним из самых популярных методов аналитической масс-спектрометрии для анализа крупных органических молекул.

Основной принцип «мягкой» десорбции можно представить следующим образом. Если соединение АВ, находящееся в конденсированном состоянии, подвергается нагреву, то переход его в газовую фазу может происходить как с разложением на фрагменты А и B, так и с испарением в виде целой молекулы AB:

AB → A+B (процесс разложения);

AB→ AB (процесс испарения).

Константы скорости таких процессов в простейшем приближении можно описать уравнением Аррениуса и записать в следующем виде:

${\displaystyle lnK_{d}=lnF_{d}-{E_{d} \over RT}}$

${\displaystyle lnK_{v}=lnF_{v}-{E_{v} \over RT}}$

где ${\displaystyle F_{v}}$ и ${\displaystyle F_{v}}$ — предэкспоненциальные множители; ${\displaystyle E_{d}}$ и ${\displaystyle E_{v}}$ — энергии активации для процессов разложения и испарения, соответственно, ${\displaystyle R}$ — газовая постоянная и ${\displaystyle T}$ — абсолютная температура.

На рисунке схематично приведены зависимости констант скорости процессов испарения и разложения от температуры. Условием для распада термически неустойчивых соединений при испарении будет превалирование константы скорости разложения ${\displaystyle K_{d}}$ над константой скорости испарения ${\displaystyle K_{v}}$. Из-за того, что величина энергии активации испарения ${\displaystyle E_{v}}$ выше, чем энергия активации разложения ${\displaystyle E_{d}}$, угол наклона прямой, отвечающей процессу испарения ${\displaystyle lnK_{V}}$, больше, чем для процесса разложения ${\displaystyle lnK_{d}}$ относительно оси абсцисс ${\displaystyle 1/T}$. Таким образом, при низких температурах (в правой части графика) будет преобладать разложение вещества АВ, однако с увеличением температуры может быть достигнуто условие, при котором скорость процесса испарения будет существенно преобладать над разложением (левая часть графика). Иными словами, мгновенное достижение высокой температуры может привести к тому, что молекулы AB смогут испаряться без разложения.

Десорбционные ионизационные методы можно разделить на две группы по методам энергетического воздействия на анализируемое вещество (см. таблицу): десорбция, индуцированная либо бомбардировкой высокоэнергетическими частицами (ББА, ВИМС, ПД), либо воздействием лазерным излучением (лазерная десорбция/ионизация (ЛД) и модификации на её основе — МАЛДИ и др.).

В случае ББА и ВИМС бомбардирующими частицами являются либо нейтральные атомы (например, Ar, Xe), либо ионы (например, Cs+, (CsI)_mCs⁺). Кинетическая энергия таких частиц составляет несколько кэВ. Например, ион Cs⁺, разогнанный при ускоряющем напряжении от 5 до 35 кВ, приобретает скорость от 2,2⋅10⁵ до 8,4⋅10⁵ м/с. Предполагая, что время взаимодействия (столкновения) ионизирующей частицы с мишенью составляет 0,1 нс, мощность излучения будет составлять от 0,8•10-5 до 5,6•10-5 Дж/с. Эта величина зависит, соответственно, от скорости и массы бомбардирующей частицы. При увеличении мощности ток образующихся ионов возрастает, однако вместе с тем увеличивается вероятность фрагментации молекул. Пороговая величина, при которой возможны процессы десорбции и ионизации, приблизительно равна ~10⁻⁵ Дж/с.^[7] Вместе с тем, величина площади соударения чрезвычайно мала и плотность потока энергии будет составлять более чем 10⁶ Дж/см²·с.

В методе ББА пучок быстрых атомов (например, Ar) формируется в устройстве, называемом «атомной пушкой», за счет перезарядки предварительно образованных в газоразрядном устройстве ионов (Ar+). При этом вся кинетическая энергия определяется ускоряющим напряжением, прикладываемым к промежуточным образованным ионам. Ионный пучок в ВИМС формируется в основном за счет термической эмиссии ионов. Например, пучок ионов Cs⁺ (цезиевая пушка) получают разложением алюмосиликата щелочных металлов при высоких температурах (около 1000 °C). Одно из преимуществ источника ВИМС перед ББА заключается в том, что данный пучок легко фокусируется, и это позволяет также проводить исследования структуры поверхности материала с помощью атомной ВИМС.

В плазменной десорбции ионизирующие частицы образуются за счет радиоактивного распада нуклида ²⁵²Cf. Основной его особенностью является то, что наряду с доминирующим α-распадом (98 %), происходит также спонтанное деление нуклида. Последнее явление и нашло своё применение в ПД масс спектрометрии. ²⁵²Сf распадается на два высокоэнергетических ионных осколка, эмитируемых в противоположные направления на 180° друг от друга. Распад сопровождается большим выделением энергии, которая в значительной степени переходит в кинетическую энергию осколочных частиц и составляет 90-130 МэВ. Набор образуемых фрагментов достаточно широк, для них характерен разброс по кинетической энергии и высокие заряды ионов. Наиболее распространенным среди них является ион технеция (Tc) с кинетической энергией 100 МэВ и зарядом +20. Пучок частиц распада проходит через тонкую металлическую фольгу, на поверхности которой расположен анализируемый образец, вызывая быстрый нагрев на несколько тысяч Кельвинов и десорбцию образца.

Наконец, последний из обсуждаемых десорбционных методов ― лазерная десорбция. Этот метод больше известен благодаря его модификации МАЛДИ. Источником ионизации служат различные типы импульсных лазеров (газовые, твердотельные, лазеры на красителях). Используемые длины волн для получения ионов лежат в диапазонах либо ближнего УФ, либо в ИК-области. Абсолютное большинство коммерческих масс спектрометров МАЛДИ работают только на азотном лазере, с длиной волны излучения 337 нм (3,68 эВ), то есть в области ближнего ультрафиолета, и длительностью импульса в несколько наносекунд.

Масс-спектрометрия ББА отличается от ВИМС в жидкой матрице лишь тем, что в качестве первичных частиц используются нейтральные ускоренные частицы. Считается, что механизм образования ионов в обоих случаях довольно похож. За редким исключением масс-спектры обоих методов мало друг от друга отличаются.

Наблюдаемые молекулярные или квазимолекулярные ионы могут присутствовать в масс-спектрах в следующем виде:

1) Протонированные / депротонированные молекулы ([М+Н]⁺, [М-Н]⁺ [M+H]⁻, [M-H]⁻);

2) Катионированные / анионированные молекулы ([M+cat]⁺ (например, [M+Na]+), [M+an]⁻ (например, [M+Cl]⁻);

3) Радикал-ионы (M^+•, M^-•);

4) Кластерные ([cationnanionn+1]⁻, [M(M+H)]⁺; [cationnanionn+1]⁻, [M(M-H)]⁻).

Чаще всего наблюдаемые ионы в спектрах — это ионы с четным числом электронов: протонированные или депротонированные ионы ([M+H]⁺, [M-H]⁻) и катионированные ионы ([M+cat]⁺). Для полиароматических соединений (например, нафталин, антрацен, фуллерен), где возможна стабилизация радикалов путём делокализации электронной плотности по сопряженной системе двойных связей, характерны радикал-ионы с нечетным числом электронов.

Ионы анализируемого вещества генерируются из капли раствора объемом в несколько микролитров, нанесенного на поверхность площадью 20-25 мм². Как минимум, раствор содержит два компонента — растворитель (матрица) и растворенное в ней исследуемое вещество. Жидкость должна иметь малое давление паров (p < 10⁻³ Па).^[8]

Наиболее распространёнными матрицами в ББА и ВИМС являются глицерин, тиоглицерин и м-нитробензиловый спирт. Для образования положительных протонированных молекул исследуемого вещества используют, как правило, глицерин и тиоглицерин. У тиоглицерина несколько выше давление паров, чем у глицерина. Однако благодаря его более высокой кислотности, выходной сигнал протонированных ионов более интенсивен. Слой глицерина испаряется со скоростью 50 нм/с даже при отсутствии бомбардировки частицами, поэтому время жизни капли глицерина (объемом в несколько микролитров) в вакууме составляет 10-20 минут. С его испарением в приповерхностной области концентрация молекул, растворенных в матрице, становится выше, чем в объеме. Вместе с тем, при облучении образца происходит постоянное пополнение поверхностного слоя неповрежденными исследуемыми молекулами. Таким образом, устраняется влияние радиационных повреждений молекул вещества, характерное для ББА (ВИМС) на твердых образцах.

Кинетическая энергия бомбардирующего атома или иона рассеивается при столкновении с молекулами жидкой мишени. Материал, удаляемый с бомбардируемой поверхности, состоит главным образом из молекул и кластеров, причем часть из них возбуждена и ионизована. В области вблизи поверхности существует заметное локальное давление. Эту область принято называть «кромкой» (selvedge region). В ней возможны такие процессы, как химическая ионизация (ион-молекулярное взаимодействие между заряженными и нейтральными частицами) и столкновительная стабилизация возбужденных молекулярных ионов.

Наиболее простой способ образования ионов — прямая десорбция ионов (модель «предшественника» — precursor model). Это возможно в том случае, когда предварительно сформированные ионы молекул (или кластеры молекул) уже существуют на поверхности. Это характерно для большинства неорганических и органических солей, сильных оснований и кислот. При бомбардировке частицами происходит десорбция и распад таких молекул, соответственно, на положительные и отрицательные ионы:

cation⁺anion⁻ (конд.) → cation⁺(газ) + anion⁻(газ).

Протонирование или катионирование может протекать как в конденсированной, так и в газовой фазе. Присоединение катиона щелочных металлов к молекуле (например, [М+Na]⁺) легко происходит, если эти ионы изначально присутствуют в растворе в виде их солей. [M+H]+ ионы образуются похожим образом: свободные протоны могут быть присоединены к молекуле в результате кислотно-основного взаимодействия в растворе в присутствии сильной кислоты. В конечном счете, образование уже отдельных ионов может происходить за счет десольватации:

[М + Na⁺ + (глицерин)n ] → [М +Na ⁺ (глицерин)n-1]⁺,

[М + Na⁺ + глицерин ] → [М +Na]⁺

или

[М + H⁺ + глицерин ] → [М +H]⁺.

Другой способ ионизации (модель «химической ионизации») заключается в том, что значительная часть ионов образуется в газовой фазе за счет ион-молекулярных реакций. На начальном этапе при бомбардировке частицами непосредственно у поверхности образца в области «кромки» образуются ионы реагенты, которые преимущественно состоят из ионов растворителя (матрицы). Например, для глицериновой матрицы основным таким газом-реагентом является его протонированный молекулярный ион (GlyН⁺).^[9] Реакции, ведущие к его образованию, могут быть представлены в следующем виде:

Xe + Gly → Pi + + Xe + e⁻ (или С⁻), (1)

Pi + + Gly → GlyH+ + (Pi-H), (2)

где Xe — бомбардирующий атом, Gly — глицериновая матрица, Pi — первичный ион и отрицательно заряженная частица в виде электрона (e⁻) или фрагмента С⁻.

За реакциями (1) и (2) следует протонизация анализируемого вещества:

GlyH⁺ + An → AnH⁺ + Gly. (3)

Для регистрации интенсивного сигнала иона AnH⁺ необходимо, чтобы сродство к протону в газовой фазе (СП) анализируемого вещества (An) была выше, чем СП глицерина. В противном случае такая реакция будет эндотермической и константа скорости ион-молекулярной реакции (3) будет крайне низкой.

Зависимость отношения интенсивностей токов в значительной степени определяется разностью СП между двумя веществами. Если СП анализируемого соединения было выше чем у матрицы, то в масс-спектре регистрируется его более интенсивный сигнал протонированного иона относительно матричного иона. И по мере роста разности между СП (анализируемое вещество) и СП (матрица) соотношение интенсивностей между ионами исследуемого вещества и матрицы увеличиваеся.

Когда в образце присутствовует эквимолярная смесь анализируемых соединений в глицериновой матрице с различными значениями СП в масс-спектре наблюдается эффект подавления сигнала протонированного иона одного вещества (An1) другим (An2), который обладает бóльшим СП, то есть СП (An1) < СП (An2). При этом способность присоединять протон в растворе (константа кислотности анализируемых соединений в глицерине) никакой роли на распределение ионов в масс-спектре не играет. В итоге в рамках рассматриваемой модели механизм образования протонированных ионов можно представить в виде следующей последовательности реакций^[10]:

1) перенос протона между матрицей и анализируемым веществом:

GlyH⁺ + An1 → An1H⁺ + Gly, (3а)

GlyH⁺ + An2 → An2H⁺ + Gly. (3б)

2) перенос протона между двумя анализируемыми веществами:

[An1H]⁺ + An2 → An1 + An2H⁺. (3в)

Диапазон кинетической энергии бомбардирующих частиц для ПД МС лежит в области МэВ, что на три порядка больше энергии первичных частиц в ББА и ВИМС. Отсюда следует и совершенно другой механизм образования ионов. Если для частиц с кэВ потеря энергии происходит, главным образом, за счет рассеяния частиц ядром атома мишени (режим ядерного торможения), то для частиц с МэВ потеря энергии происходит за счет взаимодействия частицы с электронами в мишени (режим электронного торможения).

Частицы, образующиеся в результате радиоактивного распада, проходят сквозь металлическую фольгу (толщиной 10⁻³ мм), на которую нанесен образец. Происходит почти мгновенное выделение большой энергии, локальный разогрев до 10 000 К. Это приводит к выбросу ионов, электронов и образует высокотемпературную плазму.

Время, за которое протекает этот процесс, порядка периода колебаний атомов в решетке, то есть ~10⁻¹³ с. За такой малый период времени очень низка вероятность, что образуемые молекулярные ионы успеют диссоциировать на фрагменты. При такой ионизации образуются крайне низкие ионные токи: лишь одно из десяти столкновений приводит к образованию молекулярного иона. Поэтому для регистрации образуемых ионов необходимо накопить сигнал после 10⁶−10⁷ раз облучения частицами распада, что занимает по времени от 10 до 100 минут анализа.

Образец, представляющий собой твердый раствор или твердую смесь анализируемого вещества в матрице, облучают лазером с длительностью импульса несколько наносекунд с высокими значениями удельной мощности излучения (10⁶−10⁷ Вт/см²). Переданной энергии, как правило, бывает достаточно для возникновения локального нагрева: выделяется значительная энергия, которая переходит в энергию электронного и колебательного возбуждения, а также кинетическую энергию молекул. Таким образом, в области светового пятна происходит испарение или сублимация образца.

На первой стадии происходит выброс материала в виде эмиссии микрочастиц. Такие частицы могут достигать размеров более чем несколько сот микрометров, а скорость десорбции их может составлять 600—800 м/с. Над поверхностью образца возникает область высокого локального давления — так называемый факел (англ. plume — факел, шлейф, султан), который преимущественно состоит из нейтральных частиц. Вместе с тем, в нем наблюдаются и заряженные частицы, доля которых по разным оценкам составляет 10⁻⁵−10⁻³ от полного числа всех частиц.

На начальном этапе образования факела его плотность близка по величине плотности вещества в конденсированном состоянии. C расширением факела (в первые наносекунды) происходит распад конгломератов вплоть до образования отдельных молекул или их фрагментов, а также заряженных (преимущественно матричных) частиц. Ионизацию молекул, происходящую непосредственно при выбросе материала из конденсированного состояния, принято рассматривать как первичную. Разница во времени с начала момента импульса лазера до появления матричных ионов составляет примерно несколько нс.

В образующемся расширяющемся факеле происходят непрерывные соударения между частицами, в том числе возможны ион-молекулярные реакции между матричными заряженными частицами и молекулами анализируемого вещества, которые приводят к ионизации последнего. Такого рода ионизацию относят к вторичной.

1) Фотоионизация

В простейшем случае фотоионизация молекул может быть представлена в виде прямой многофотонной ионизации:

M + hν → M^*;

M^* + n (hν) → M^+• + e⁻.

Как правило, промежуточное электронно-возбужденное состояние молекулы (M^*) длится порядка 10⁻⁹−10⁻⁸ с, так что один или несколько фотонов могут быть поглощены вплоть до образования матричного радикального катиона и свободного электрона. Однако при характерных для МАЛДИ интенсивностях излучения (10⁶−10⁷ Вт/см²) возможна лишь прямая одно- или двухступенчатая ионизация. Таким образом, для ионизации отдельной молекулы необходимо, чтобы, по крайней мере, энергия двух фотонов лазера (7,36 эВ для азотного лазера) была больше, чем энергия ионизации молекулы.

Для ионизации в газовой фазе многих матричных молекул энергии двух фотонов недостаточно. В этом случае предполагается, что первоначально облучение приводит к образованию возбужденного матричного кластера(M^*M^*), распад которого может протекать по следующим механизмам:

а) распад кластера с образованием радикала и радикал-катиона:

MM + 2hν → M^*M^* → M^• + M^+. + e⁻ ;

б) по реакции диспропорционирования:

MM + 2hν → M^*M^* → [M-H]⁻ + MH⁺,

MM + 2hν → M^*M^* → M^+• + M^-•.

2) Разделение зарядов (charge separation)

При лазерной абляции образуются кластеры с определенным набором локально распределенных зарядовых состояний, которые затем при распаде кластера отражают состав и тип образуемых ионов. Образование ионов происходит в результате десольватации матрицы и (или) остаточного растворителя.

Для пептидов и белков, для анализа которых используют кислотные матрицы (например, 2,5-дигидроксибензойная кислота), образование ионов может быть представлено следующим образом:

{[Analyte+nH]ⁿ⁺ + (n-1)A⁻ + x ma} → [Analyte+H]⁺ + (n-1)AH + x ma,

где Аnalyte — молекула белка/пептида, ma — матрица, A — анион матричной молекулы. Для олигонуклеотидов рекомендуется применять 2,4,6-тригидроксиацетофенон в качестве матрицы. В этом случае матрица играет роль основания (B) и при ионизации образуются преимущественно отрицательные ионы:

{[Analyte-nH]^n- + (n-1)BH+ + x ma} → [Analyte-H]⁻ + (n-1)B + x ma.

Ионизация многих полярных органических соединений чаще всего происходит благодаря переносу протона от протонированной формы матричного иона (MH⁺) к молекуле анализируемого вещества (A). Ионы MH⁺ могут образовываться как в результате первичной ионизации (см. выше), так и вторичной.

1) Реакция «матрица-матрица»

Процесс образования матричных ионов в газовой фазе MH⁺ можно рассматривать как одну из промежуточных стадий протонирования молекулы анализируемого вещества. Если первичными ионами являются радикал-катионы, то протонирование матрицы может происходить следующим образом:

M^+• + M → MH⁺ + [M-H]^•.

Образующийся радикал [M-H]^• в дальнейшем может присоединить свободный электрон, что приводит к образованию отрицательного иона [M-H]⁻:

[M-H]^• + e⁻ → [M-H]⁻.

Также депротонированные ионы могут образовываться при диссоциативном электронном захвате:

M + e⁻ → [M-H]⁻ + H^•.

2) Реакция «матрица-анализируемое вещество»

Вслед за взаимодействием «матрица-матрица» возможно образование протонированных ионов анализируемого вещества по следующему механизму:

MH⁺ + A → M + AH⁺.

Такой механизм лежит в основе образования протонированных ионов белков и пептидов. Как правило, сродство к протону у данных веществ больше (> 900 кДж/моль), чем у многих известных матричных соединений (850—900 кДж/моль).

Другой возможный путь вторичной ионизации анализируемого вещества — взаимодействие депротонированного матричного иона с молекулой анализируемого вещества:

[M-H]⁻ + A → M + [A-H]⁻.

Для целого ряда соединений (синтетические полимеры, полисахариды) катионизация является одним из основных путей вторичной ионизации. Предполагается, что катионированные ионы образуются в результате переноса катиона металла от матричного иона (MMet⁺) к анализируемому веществу (A):

[MMet]⁺ + A → M⁺ + AMet⁺, где Met=Na, K, Ag, Cu и др.

Как правило, в процессе пробоподготовки при анализе таких соединений в качестве добавки к матрице (например, дитранол) применяют такие катионизирующие агенты, как трифторацетат серебра, гидрокарбонат натрия и др.

Для молекул с низкими значениями энергии ионизации характерно образование радикал-катионов с нечетным числом электронов. Образование А^+• ионов может происходить в результате взаимодействия матричных радикал-катионов и нейтральных молекул анализируемого вещества путём переноса электрона:

M^+• + A → M + A^+•.

• Koichi Tanaka. Nobel Lecture The Origin of Macromolecule Ionization by Laser Irradiation (англ.)