Кумасси

Перейти к навигацииПерейти к поиску
Не следует путать с Бриллиантовый синий FCF.
Coomassie Brilliant Blue
Изображение химической структуры
Изображение молекулярной модели
Изображение молекулярной модели
Общие
Традиционные названия C.I. 42660, C.I. Acid Blue 83
Brilliant indocyanine 6B, Brillantindocyanin 6B
Brilliant Cyanine 6B, Serva Blue R
Хим. формулаC45H44N3NaO7S2 (натриевая соль)
Физические свойства
Молярная масса825,97 г/моль
Химические свойства
Растворимость
 • в воде нерастворимо в холодной воде, плохо растворимо в горячей воде, растворимо в этаноле
Классификация
Рег. номер CAS6104-59-2
PubChem61365
Рег. номер EINECS228-060-5
SMILES
 
InChI
 
ChemSpider55296
Безопасность
Краткие характер. опасности (H)
H201, H202, H235+H410
Меры предостор. (P)
P201
Пиктограммы СГСПиктограмма «Газовый баллон» системы СГСПиктограмма «Взрывающаяся бомба» системы СГС
NFPA 704
Приведены данные для стандартных условий (25 °C, 100 кПа), если не указано иное.
Логотип Викисклада Медиафайлы на Викискладе

Coomassie Brilliant Blue (кумасси бриллиантовый синий) — название двух близких трифенилметановых красителей, разработанных для текстильной индустрии, но в настоящее время широко используемых в аналитической биохимии для окраски белков. Coomassie Brilliant Blue G-250 отличается от R-250 наличием двух метильных групп. Название «Coomassie» — зарегистрированный товарный знак Imperial Chemical Industries.

Название и история открытия

Название Кумасси было зарегистрировано в конце 19 века в качестве торговой марки компанией Blackley, для красителей шерсти.[1] В 1896 году в ходе Четвертой Англо-ашантийской войны, войска Великобритании заняли город Coomassie (в настоящее время Кумаси в Гане). В 1918 году компания Levinstein Ltd, владелец торговой марки Кумасси, стала частью компании British Dyestuffs, которая в 1926 году была поглощена компанией Imperial Chemical Industries.[2] В настоящее время компания Imperial Chemical Industries не производит красителей, но остается владельцем торговой марки Coomassie .

Синие красители на основе сернистных производных трифенилметана были впервые получены в 1913 году Максом Вейлером, который работал в городе Вупперталь (Германия).[3][4][5][6]

Статьи в биохимических журналах часто не расшифровывают, какой именно краситель «Coomassie» был использован. Перечень цветов en:Colour Index International содержит более 40 красителей, содержащих термин «Coomassie» в названии. Синий краситель кумасси из перечня Merck Index (10th edition) — Coomassie Blue RL (Acid Blue 92, C.I. 13390) имеет совершенно иную структуру.

Цвет красителя

Раствор бриллиантового синего кумасси G в изопропаноле

Суффикс «R» в названии красителя Coomassie Brilliant Blue R-250 является аббревиатурой от слова Red (красный), так как синий цвет красителя имеет слабый красноватый оттенок. Вариант красителя с суффиксом «G» имеет слабый зеленоватый оттенок. Цифры «250» обозначали чистоту красителя.

Цвет красителей зависит от кислотности среды. Краситель «G» подробно изучен.[7] При pH ниже 0 краситель имеет красную окраску и максимум поглощения на длине 470 нм. При pH около 1 краситель зеленый и максимум поглощения составляет 620 нм. При рН выше 2 краситель ярко-синий, максимум поглощения на 595. При pH 7 краситель имеет коэффициент молярной экстинкции 43,000 M−1см−1.[7]

Изменение окраски раствора соответствует изменению заряда молекулы красителя. В красной форме три атома азота заряжены положительно. Два остатка серной кислоты имеют очень низкий pKa и потому обычно заряжены отрицательно, поэтому при pH близких к нулю, краситель представляет собой катион с суммарным зарядом +1. Зеленый цвет соответствует незаряженной молекуле. При pH 7 лишь атом азота в составе дифениламина имеет положительный заряд, поэтому молекула в целом является анионом с суммарным зарядом −1. Значения pKa, необходимые для потери двух протонов составляют 1,15 и 1,82. Последний протон отрывается в щелочной среде, при этом молекула приобретает розовую окраску (pKa 12,4).[7]

Красители образуют комплекс с анионными детергентами, например, с лаурилсульфатом натрия.[8] Образование такого комплекса стабилизирует зеленый цвет нейтральной формы красителя. Этот эффект может оказывать влияние на определение концентрации при помощи метода Бредфорда. Вероятно, анионные детергенты конкурируют с красителем за связывание с белком.

Использование в биохимии

Раствор бриллиантового синего кумасси (справа) подготовленный для вестерн-блоттинга

Coomassie Brilliant Blue R-250 был использован для окрашивания белков в 1964 году[9]. Образцы белков были разделены электрофорезом на листе ацетата целлюлозы. Лист помещали в сульфосалициловую кислоту для фиксации белков и затем переносили в раствор красителя.

В 1965 году Coomassie Brilliant Blue R-250 был использован для окрашивания белков после электрофоретического разделения в полиакриламидном геле[10]. Гель помещали в раствор красителя, содержащий метанол, уксусную кислоту и воду. После окрашивания белков полиакриамидный гель (ПААГ) должен был быть отмыт электрофоретически. Далее было показано, что гель может быть отмыт раствором уксусной кислоты.

Краситель «G» был впервые использован для визуализации белков в полиакриламидном геле в 1967 году, при этом краситель растворяли в растворе уксусной кислоты с метанолом[11].

Позднее было показано, что белковые полосы могут быть окрашены без коллоидного красителя «G», в растворе трихлоруксусной кислоты без метанола. Использование этого протокола не требует отмывания геля[12].

Современные протоколы используют коллоидную форму красителя «G» в растворе, содержащем фосфорную кислоту, этанол (или метанол) и сульфат аммония[13][14][15][16].

Метод Бредфорда использует спектральные свойства Coomassie Brilliant Blue G-250 для определения количества белка в растворе[17]. Для этого к образцу белка добавляют раствор красителя в фосфорной кислоте и этаноле. В кислых условиях краска имеет коричневый цвет, но при связывании с белком становится синей. Оптическое поглощение раствора измеряют на длине волны 595 нм.

Связывание белка с отрицательно заряженным Coomassie Brilliant Blue G-250 придаёт белку отрицательный заряд, что может быть использовано при разделении смесей белков в ПААГ в неденатурирующих условиях при помощи метода Blue Native PAGE[18][19].

Подвижность комплекса в полиакриламидном геле зависит от размера белка, белкового комплекса, а также количества красителя, связываемого белком.

См. также

Примечания

  1. ↑ Fox, M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes (англ.). — Manchester: Imperial Chemical Industries, 1987. — P. 38.
  2. ↑ Fox, M. R. Dye-makers of Great Britain 1856-1976 : A History of Chemists, Companies, Products and Changes (англ.). — Manchester: Imperial Chemical Industries, 1987. — P. 259.
  3. ↑ Colour Index (неопр.). — 3rd. — Bradford: Society of Dyers and Colourists, 1971. — Т. 4. — С. 4397—4398. Архивировано 19 июля 2011 года. Архивированная копия. Дата обращения: 27 мая 2013. Архивировано 19 июля 2011 года.
  4. ↑ , "Procédé de production de colorants de la série du triarylméthane", FR patent 474260, issued 1915-02-16
  5. ↑ Weiler, Max, "Blue Triphenylmethane Dye", US patent 1218232, issued 1917-03-06
  6. ↑ , "Manufacture of Triarylmethane-dyestuffs", GB patent 275609, issued 1927-11-03
  7. ↑ 1 2 3 Chial, H. J.; Thompson, H. B.; Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G (англ.) // Analytical Biochemistry[англ.] : journal. — 1993. — Vol. 209, no. 2. — P. 258—266. — doi:10.1006/abio.1993.1117. — PMID 7682385.
  8. ↑ Compton, S. J.; Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay (англ.) // Analytical Biochemistry[англ.] : journal. — 1985. — Vol. 151, no. 2. — P. 369—374. — doi:10.1016/0003-2697(85)90190-3. — PMID 4096375.
  9. ↑ Fazekas de St. Groth, S.; Webster, R. G.; Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips (англ.) // Biochimica et Biophysica Acta[англ.] : journal. — 1963. — Vol. 71. — P. 377—391. — doi:10.1016/0006-3002(63)91092-8. — PMID 18421828.
  10. ↑ Meyer, T. S.; Lambert, B. L. Use of Coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips (англ.) // Biochimica et Biophysica Acta[англ.] : journal. — 1965. — Vol. 107, no. 1. — P. 144—145. — doi:10.1016/0304-4165(65)90403-4. — PMID 4159310.
  11. ↑ Altschul, A. M.; Evans, W. J. Zone electrophoresis with polyacrylamide gel (англ.) // Methods in Enzymology : journal. — 1967. — Vol. 11. — P. 179—186. — doi:10.1016/S0076-6879(67)11019-7.. Page 184 personal communication from W. J. Saphonov.
  12. ↑ Diezel, W.; Kopperschläger, G.; Hofmann, E. An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue (англ.) // Analytical Biochemistry[англ.] : journal. — 1972. — Vol. 48, no. 2. — P. 617—620. — doi:10.1016/0003-2697(72)90117-0. — PMID 4115985.
  13. ↑ Neuhoff, V.; Stamm, R.; Eibl, H. Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: a systematic analysis (англ.) // Electrophoresis : journal. — 1985. — Vol. 6, no. 9. — P. 427—448. — doi:10.1002/elps.1150060905.
  14. ↑ Candiano, G.; Bruschi, M.; Musante, L.; Santucci, L.; Ghiggeri, G. M.; Carnemolla, B.; Orecchia, P.; Zardi, L.; Righetti, P. G. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis (англ.) // Electrophoresis : journal. — 2004. — Vol. 25, no. 9. — P. 1327—1333. — doi:10.1002/elps.200305844. — PMID 15174055.
  15. ↑ Steinberg, T. H. Protein gel staining methods: an introduction and overview (англ.) // Methods in Enzymology : journal. — 2009. — Vol. 463. — P. 541—563. — doi:10.1016/S0076-6879(09)63031-7. — PMID 19892191.
  16. ↑ Pink, M.; Verma, N.; Rettenmeier, A. W.; Schmitz-Spanke, S. CBB staining protocol with higher sensitivity and mass spectrometric compatibility (англ.) // Electrophoresis : journal. — 2010. — Vol. 31, no. 4. — P. 593—598. — doi:10.1002/elps.200900481. — PMID 20162584.
  17. ↑ Bradford, M. M.[англ.]. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding (англ.) // Analytical Biochemistry[англ.] : journal. — 1976. — Vol. 72. — P. 248—254. — doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3. — PMID 942051.
  18. ↑ Schägger, H.; Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form (англ.) // Analytical Biochemistry[англ.] : journal. — 1991. — Vol. 199, no. 2. — P. 223—231. — doi:10.1016/0003-2697(91)90094-A. — PMID 1812789.
  19. ↑ Wittig, I.; Braun, H. P.; Schägger, H. Blue native PAGE (англ.) // Nature Protocols[англ.] : journal. — 2006. — Vol. 1, no. 1. — P. 418—428. — doi:10.1038/nprot.2006.62. — PMID 17406264.

Литература

  • Gessner, T.; Mayer, U. (2002), "Triarylmethane and Diarylmethane Dyes", Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry 6th Edition, Weinheim: Wiley-VCH, doi:10.1002/14356007.a27_179

Протоколы