Нозерн-блот

Перейти к навигацииПерейти к поиску
Общая схема метода

Нозерн-блот (англ. Northern blot) — метод исследования экспрессии генов путём тестирования молекул РНК (мРНК) и их фрагментов в образцах.

Метод Нозерн-блот был предложен в 1977 году сотрудниками Стэнфордского университета Джеймсом Олвайном, Дэвидом Кемпом и Джорджем Старком[1] и назван по его аналогии с Саузерн-блот — первым из методов блоттинга, предложенным Эдвином Саузерном[2]. Основным отличием метода Нозерн-блот от Саузерн-блот является то, что определяемым субстратом является не ДНК, а РНК. Это обуславливает различия в методике — вместо нитроцеллюлозного используется фильтр из диазобензилоксиметил-целлюлозы, в качестве зондов используют комплементарные молекулы ДНК и т. д.

Нозерн-блоттинг протокол

Нозерн-блоттинг осуществляется в следующие этапы:

a. Разделение РНК на денатурирующем геле:

  1. Подготовьте раствор геля для РНК, добавив формальдегид в агарозу.
  2. Соберите форму для геля и залейте в неё денатурирующий гель. Вставьте гребень для формирования лунок.[3]
  3. После застывания удалите гребень и уравновесьте гель в буферном растворе в течение 30 минут.
  4. Смешайте 15 мкг образца РНК с загрузочным буфером для РНК; аналогично добавьте 3 мкг маркеров РНК.
  5. Инкубируйте образцы при 65°C в течение 12-15 минут.[4]
  6. Загрузите образцы и маркеры РНК в лунки геля.
  7. Запустите электрофорез при 125 В в течение около 3 часов.[3]

b. Перенос РНК с геля на нейлоновую мембрану:

  1. Вырежьте нейлоновую мембрану и фильтровальную бумагу большего размера, чем гель.
  2. Удалите гель из резервуара после электрофореза и промойте водой.[5]
  3. Поместите слегка большую прямоугольную губку в стеклянную посуду, наполовину погруженную в буфер SSC.[5]
  4. Положите увлажненные бумаги Whatman 3мм на губку.
  5. Поместите гель на фильтровальную бумагу, удаляя воздушные пузыри стеклянной пипеткой.[6]
  6. Увлажните нейлоновую мембрану дистиллированной водой в течение 5 минут и поместите её на гель.
  7. Добавьте буфер SSC и ещё несколько фильтровальных бумаг на мембрану.[7]
  8. Поместите стеклянную пластину сверху и оставьте на ночь для эффективного переноса.

c. Иммобилизация:

  1. Удалите гель и промойте его в буфере SSC, затем дайте высохнуть.
  2. Поместите мембрану между фильтровальными бумагами и запеките в вакуумной печи при 80°C в течение 2 часов.
  3. Альтернативно, оберните мембрану в УФ-прозрачную пластиковую пленку и облучайте на УФ-трансиллюминаторе.[8]

d. Гибридизация:

  1. Метите ДНК или РНК зонды до специфической активности >108 dpm/µg и удалите неинкорпорированные нуклеотиды.
  2. Увлажните мембрану в буфере SSC.[9]
  3. Поместите мембрану в гибридизационную трубку РНК-стороной вверх и добавьте 1 мл формальдегидного раствора.
  4. Инкубируйте трубку в гибридизационной печи при 42°C в течение 3 часов.[6]
  5. Если используются двуцепочечные зонды, денатурируйте их, нагревая при 100°C в течение 10 минут.
  6. Добавьте необходимый объем зонда в трубку и инкубируйте при 42°C.
  7. Слейте раствор, промойте мембрану моющим раствором и наблюдайте под авторентгенографией.[5]

Примечания

  1. Alwine J. C., Kemp D. J., Stark G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal. — 1977. — Vol. 74, no. 12. — P. 5350—5354. — doi:10.1073/pnas.74.12.5350. — PMID 414220. — PMC 431715.
  2. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538—539.
  3. 1 2 Northern blot | Learn Science at Scitable (англ.). www.nature.com. Дата обращения: 23 июня 2024. Архивировано 21 марта 2023 года.
  4. Shan L. He. Northern blot // Methods in enzymology. — 2013. — Т. 530. — С. 75–87. — ISSN 0076-6879. — doi:10.1016/B978-0-12-420037-1.00003-8. Архивировано 9 августа 2020 года.
  5. 1 2 3 Tao Yang, Mingdi Zhang, Nianhui Zhang. Modified Northern blot protocol for easy detection of mRNAs in total RNA using radiolabeled probes // BMC Genomics. — 2022-01-20. — Т. 23. — С. 66. — ISSN 1471-2164. — doi:10.1186/s12864-021-08275-w. Архивировано 10 июня 2024 года.
  6. 1 2 Sylvia Streit, Christoph W. Michalski, Mert Erkan, Jörg Kleeff, Helmut Friess. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues (англ.) // Nature Protocols. — 2009-01. — Vol. 4, iss. 1. — P. 37–43. — ISSN 1750-2799. — doi:10.1038/nprot.2008.216. Архивировано 9 июля 2023 года.
  7. M.Sc, Susha Cheriyedath Northern Blot / RNA Blot (англ.). News-Medical (25 апреля 2016). Дата обращения: 23 июня 2024. Архивировано 23 июня 2024 года.
  8. Northern Blotting - Protocol, Principle, Application, Result - Biology Notes Online (амер. англ.). biologynotesonline.com (16 апреля 2024). Дата обращения: 23 июня 2024. Архивировано 26 июня 2024 года.
  9. Northern Blotting (амер. англ.). Azure Biosystems. Дата обращения: 23 июня 2024. Архивировано 1 марта 2024 года.