Электронный микроскоп

Электро́нный микроско́п (ЭМ) — прибор (микроскоп), позволяющий получать изображение объектов с максимальным увеличением до 10⁶ раз, благодаря использованию, в отличие от оптического микроскопа, вместо светового потока, пучка электронов^[1] с энергиями 200 эВ — 400 кэВ и более (например, просвечивающие электронные микроскопы высокого разрешения с ускоряющим напряжением 1 МВ).

Длина волны де Бройля электронов, ускоренных в электрическом поле с разностью потенциалов 1000 В, равна 0,4 Å, что много меньше длины волны видимого света^[2]. Вследствие этого, разрешающая способность электронного микроскопа в более чем 10000 раз может превосходить разрешение традиционного оптического микроскопа. Для получения изображения в электронном микроскопе используются специальные магнитные линзы, управляющие движением электронов в колонне прибора при помощи электромагнитного поля.

Основные вехи в истории электронной микроскопии^[3]:

1897 — Томсон (J. J. Thomson) открыл электрон.

1924 — Де Бройль (de Broglie) предположил существование у электрона волновых свойств

1926 — Буш (Busch) продемонстрировал возможность фокусировки электронного потока с помощью магнитных линз цилиндрической формы. Это положило начало ЭМ.

1931 — Р. Руденберг получил патент на просвечивающий ЭМ; в 1931 году М. Кнолль и Эрнст Руска построили первый прототип современного прибора. Эта работа Руски в 1986 году была отмечена Нобелевской премией по физике, которую присудили ему и изобретателям сканирующего зондового микроскопа Герду Карлу Биннигу и Генриху Рореру. Использование просвечивающего электронного микроскопа для научных исследований было начато в конце 1930-х годов, и тогда же появился первый коммерческий прибор, построенный фирмой Siemens.

1935 — Кнолль (Knoll) описал принцип работы сканирующего электронного микроскопа. Позднее, в 1938, Ардене (Von Ardene) создал прототип такого микроскопа.

1939 — Сименс (Siemens) создал первый просвечивающий электронный микроскоп.

Конец 1930-х – начало 1940-х годов — появились первые растровые электронные микроскопы, формирующие изображение объекта при последовательном перемещении электронного зонда малого сечения по объекту. Массовое применение этих приборов в научных исследованиях началось в 1960-х годах, когда они достигли значительного технического совершенства.

1944 — Уильямс и Виков (Williams, Wyckoff) создали метод оттенения металлом.

1945 — Портер, Клод и Фуллам (Porter, Claude, Fullam) применили электронную микроскопию в цитологии, изучая фиксированные клетки и ткани после окрашивания.

1948 — Пиз и Бэйкер (Pease, Baker) получили тончайшие срезы био-образцов – около 0,1-0,2 мкм.

1952 — Паладе, Портер и Шестранд (Palade, Porter, Sjostrand) создали новые способы фиксации и приготовления тонких срезов, что впервые позволило увидеть многие внутриклеточные структуры. В числе первых эти методы применил Хаксли (Н. Е. Xuxley) , чтобы получить доказательства в пользу гипотезы "скользящих нитей", которая описывает механизм сокращения мышечной ткани. Хаксли продемонстрировал перекрывающиеся сети белковых филаментов миоцитов.

1953 — Портер и Блюм (Porter, Blum) спроектировали ультрамикротом.

1956 — Глауэрт (Glauert) вместе с сотрудниками применили смолу аралдит в качестве средства фиксации микропрепаратов. В 1961 Люфт (Luft) предложил использовать смолу эпон.

1957 — Робертсон (Robertson) описал трехслойное строение клеточной мембраны.

1957 — Мур и Мюреталер (Moor, Muhlethaler) улучшили метод "замораживания-скалывания" Стира (Steere). В 1966 г. Брентон (Branton) применил этот метод для изучения внутреннего строения мембран клеток.

1959 — Бреннер и Хорн (Bretftier, Home) улучшили метод негативного контрастирования Холла (Hall, 1955), что привело к распространению его использования.

1959 — Сингер (Singer) применил ферритин-ассоциированные антитела для детекции внутриклеточных молекул методом ЭМ.

1963 — Сабатини, Бенш и Баррнетт (Sabatini, Bensch, Barrnett) применили глутаральдегид и OsO4 для фиксации микропрепарата при ЭМ.

1965 — Cambridge Instruments коммерциализировала сканирующий ЭМ.

1968 — Де Розьер и Клуг (de Rosier, Klug) описали метод определения трехмерных структур по электронным микрофотографиям

1975 — Хендерсон и Унвин (Henderson, Unwin) впервые определили тонкое строение мембранного белка, используя реконструкцию

электронных микрофотографий неокрашенных белков на компьютере

Значительным скачком (в 1970-х годах) в развитии было использование вместо термоэмиссионных катодов — катодов Шоттки и катодов с холодной автоэмиссией, однако их применение требует значительно большего вакуума.

1979 — Хейзер, Рис (Heuser, Reese) с коллегами разработал метод глубокого травления, обладающий высокой разрешающей способностью, который использовал метод сверхбыстрой заморозки.

Конец 1990-х – начало 2000-х — компьютеризация и использование ПЗС-детекторов значительно упростили получение изображений в цифровом виде.

В последнее десятилетие в современных передовых просвечивающих электронных микроскопах используются корректоры сферических и хроматических аберраций, вносящих основные искажения в получаемое изображение. Однако их применение может значительно усложнять использование прибора.

2018 — американским учёным удалось добиться разрешения электронного микроскопа в 3,9 *10⁻¹¹ м^[4].

В просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) для формирования изображения используется высокоэнергетический электронный пучок. Электронный пучок создается посредством катода (вольфрамового, LaB₆, Шоттки или холодной полевой эмиссии). Полученный электронный пучок ускоряется обычно до 80—200 кэВ (используются различные напряжения от 20 кВ до 1 МВ), фокусируется системой магнитных линз (иногда электростатических линз), проходит через образец так, что часть электронов рассеивается на образце, а часть — нет. Таким образом, прошедший через образец электронный пучок несет информацию о структуре образца. Далее пучок проходит через систему увеличивающих линз и формирует изображение на люминесцентном экране (как правило, из сульфида цинка), фотопластинке или ПЗС-камере.

Разрешение ПЭМ лимитируется в основном сферической аберрацией. Некоторые современные ПЭМ имеют корректоры сферической аберрации.

Основными недостатками ПЭМ являются необходимость в очень тонком образце (порядка 100 нм) и неустойчивость (разложение) образцов под пучком.

Один из типов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ); однако, есть приборы, работающие исключительно в режиме ПРЭМ. Пучок электронов пропускается через относительно тонкий образец, но, в отличие от обычной просвечивающей электронной микроскопии, электронный пучок фокусируется в точку, которая перемещается по образцу по растру.

В основе лежит телевизионный принцип развёртки тонкого пучка электронов по поверхности образца.

В своих наиболее распространенных конфигурациях, электронные микроскопы дают изображения с отдельным значением яркости на каждый пиксель, с результатами, как правило, изображенными в оттенках серого.^[5] Однако, часто эти изображения затем раскрашены посредством использования программного обеспечения, или просто ручным редактированием с помощью графического редактора. Это делается обычно для эстетического эффекта или для уточнения структуры и, как правило, не добавляет информацию об образце.^[6]

В некоторых конфигурациях о свойствах образца можно собрать больше информации на каждый пиксель, благодаря использованию нескольких детекторов.^[7] В СЭМ атрибуты топографии и рельефа материала могут быть получены с помощью пары электронных детекторов отражения и такие атрибуты могут быть наложены в единое цветное изображение, с присвоением разных первичных цветов для каждого атрибута.^[8] По аналогии, сочетаниям отраженного и вторичного электронного сигнала различные цвета могут быть присвоены и наложены на один цветной микрограф, одновременно показывающий свойства образца.^[9]

Некоторые типы детекторов, используемых в СЭМ, имеют аналитические возможности и могут обеспечить несколько элементов данных на каждом пикселе. Примерами являются детекторы, используемые в элементном анализе, и системы катодолюминесцентных микроскопов, которые анализируют интенсивность и спектр электронно-стимулированной люминесценции (например, в геологических образцах). В системах СЭМ использование этих детекторов является общим для цветового кода сигналов и накладывают их в единое цветное изображение, так что различия в распределении различных компонентов образца можно ясно видеть и сравнивать. Дополнительно, стандарт вторичных электронных изображений может быть объединен с одним или более композиционными каналами, так что можно сравнить структуру и состав образца. Такие изображения могут быть сделаны с сохранением полной целостности исходного сигнала, который не изменяется в любом случае.

Электронные микроскопы дороги в производстве и обслуживании, но общая и эксплуатационная стоимость конфокального оптического микроскопа сравнима с базовыми электронными микроскопами. Микроскопы, направленные на достижение высоких разрешений, должны быть размещены в устойчивых зданиях (иногда под землёй) и без внешних электромагнитных полей. Образцы в основном должны рассматриваться в вакууме, так как молекулы, составляющие воздух, будут рассеивать электроны.

Сканирующие электронные микроскопы, работающие в обычном высоковакуумном режиме, как правило, изображают проводящий образец; Поэтому непроводящие материалы требуют проводящее покрытие (золото / палладий, сплав углерода, осмий, и т. д.); режим низкого напряжения современных микроскопов делает возможным наблюдение непроводящих образцов без покрытия. Непроводящие материалы могут быть изображены также переменным давлением (или окружающей средой) сканирующего электронного микроскопа^[].

• Электронный микроскоп / П. А. Стоянов // Экслибрис — Яя. — М. : Советская энциклопедия, 1978. — (Большая советская энциклопедия : [в 30 т.] / гл. ред. А. М. Прохоров ; 1969—1978, т. 30).
• Электронная микроскопия / А. Е. Лукьянов // Экслибрис — Яя. — М. : Советская энциклопедия, 1978. — (Большая советская энциклопедия : [в 30 т.] / гл. ред. А. М. Прохоров ; 1969—1978, т. 30).
• Применение электронной микроскопии в биологии / Н. А. Старосветская, Я. Ю. Комиссарчик // Экслибрис — Яя. — М. : Советская энциклопедия, 1978. — (Большая советская энциклопедия : [в 30 т.] / гл. ред. А. М. Прохоров ; 1969—1978, т. 30).

• «Электронный микроскоп» — статья в Малой советской энциклопедии; 2 издание; 1937—1947 гг.