Эта статья входит в число добротных статей

RecBCD

Перейти к навигацииПерейти к поиску
Дезоксирибонуклеаза V
Кристаллографическая структура фермента RecBCD. Субъединицы фермента, RecB, RecC и RecD, окрашены в голубой, зеленый и пурпурный цвет соответственно, а частично расплетенная спираль ДНК - в коричневый.
Кристаллографическая структура фермента RecBCD. Субъединицы фермента, RecB, RecC и RecD, окрашены в голубой, зеленый и пурпурный цвет соответственно, а частично расплетенная спираль ДНК - в коричневый.
Идентификаторы
Шифр КФ3.1.11.5
Номер CAS37350-26-8
Базы ферментов
IntEnzIntEnz view
BRENDABRENDA entry
ExPASyNiceZyme view
MetaCycmetabolic pathway
KEGGKEGG entry
PRIAMprofile
PDB structuresRCSB PDB PDBe PDBj PDBsum
Поиск
PMCстатьи
PubMedстатьи
NCBINCBI proteins
CAS37350-26-8

RecBCD (экзонуклеаза V, RecBC-дезоксирибонуклеаза) — фермент бактерии Escherichia coli, инициирующий процесс гомологичной рекомбинации при репарации двух- и одноцепочечных повреждений[англ.] молекулы ДНК, возникающих в результате ионизирующего излучения, ошибок в процессе репликации, ошибок в работе эндонуклеаз или в результате окислительного стресса[1][2]. RecBCD — это одновременно и хеликаза, раскручивающая двойную спираль ДНК, и нуклеаза, которая её разрезает[3].

RecBCD используется в методе одномолекулярного FRET[англ.], который используется для изучения взаимодействия белков с ДНК[4].

Структура

RecBCD представляет собой белковый комплекс, состоящий из трёх разных субъединиц: RecB, RecC и RecD. До обнаружения гена RecD[5] комплекс был известен как RecBC. Каждая субъединица кодируется отдельным геном:

Ген Цепь Белок Функция
RecB β Uniprot: RecB (P08394).3'→5' хеликаза, нуклеаза
RecC γ Uniprot: RecC (P07648).распознает Chi-сайт[англ.] (точку рекомбинации)
RecD α Uniprot: RecD (P04993).5'→3' хеликаза

Функции

АТФ-зависимый путь гомологической рекомбинации с участием RecBCD

RecD и RecC — хеликазы, то есть работающие за счёт энергии АТФ молекулярные комплексы, расплетающие ДНК, или, в некоторых случаях, РНК, при этом RecB выполняет ещё и функцию нуклеазы[6]. RecC, третья субъединица RecBCD-комплекса, распознает определённую последовательность в ДНК, а именно 5'-GCTGGTGG-3', известную как Chi-сайт, по которой происходит разрезание ДНК на этапе завершения рекомбинации. RecBCD необычен тем, что обе его хеликазы движутся вдоль цепи с разной скоростью[7], а также тем, что распознаёт конкретную последовательность ДНК (Chi-сайт)[8][9]. RecBCD связывается с концом двухцепочечной ДНК и начинает расплетать её, при этом RecD движется от 5'-конца к 3'-концу, а RecB наоборот. В ходе движения за RecBCD остаются две расплетённые цепи ДНК, которые образуют петлю, а так как RecB движется медленнее, чем RecD, петля последнего растет быстрее; образовавшуюся структуру в виде RecBCD-комплекса, движущегося вдоль цепи с двумя петлями позади себя иногда, по причине внешнего сходства, называют «кроличьи уши»[10].

К косвенным функциям RecBCD можно отнести его роль при активации эффектора, защищающего бактериальную культуру от вирусного заражения[11].

Механизм действия

Начало RecBCD-опосредованной гомологичной рекомбинации при избытке магния

Во время раскручивания ДНК нуклеазная субъединица RecB может действовать по-разному, в зависимости от условий реакции, в частности, в зависимости от концентрации ионов Mg2+ и АТФ. Если АТФ в избытке, фермент просто делает надрез на цепи, содержащей Chi-сайт[12]. Раскручивание цепи продолжается и образуется 3'-хвост с Chi-сайтом, на который может садиться белок RecA[англ.], способствующий внедрению этого хвоста в хромосому, которая будет матрицей для восстановления повреждённой цепи, и обмена с ней цепями[13]. Опознающая Chi-сайт субъединица комплекса RecBCD не взаимодействует с другими последовательностями, и фермент вскоре распадается на субъединицы, оставаясь неактивным в течение часа или более[14]. Если в избытке находятся ионы Mg2+, RecBCD, как эндонуклеаза, расщепляет обе нити ДНК, хотя 5'-конец расщепляется реже[15]. Когда RecBCD встречает Chi-сайт, раскручивание останавливается и разрушение 3'-цепи замедляется[16]. Продолжая расплетать ДНК, RecBCD сразу же разрезает противоположную цепь (то есть 5'-конец)[17][18] и загружает белок RecA на 3’-конец. После завершения этого процесса на одной молекуле ДНК фермент повторяет его снова, быстро переходя на новую молекулу[13].

Хотя реакции не были проверены с помощью анализа ДНК в самих клетках ввиду их скоротечности, генетические данные показывают, что первая реакция более всего подобна тому, что происходит в клетке[1]. Например, мутантный RecBCD, лишённый определяемой экспериментально экзонуклеазной активности, сохраняет высокую способность к разрезанию Chi-сайта во внеклеточных условиях[19]. Chi-сайт на одной молекуле ДНК в клетках подавляет активность Chi-сайта на другой, что, возможно, отражает Chi-зависимую разборку RecBCD, которая наблюдается in vitro в условиях избытка АТФ и при наличии разрыва в ДНК в области Chi-сайта[20][21].

При обоих условиях реакции 3'-конец остается интактным после Chi-сайта, рядом с которым идет активная загрузка белка RecA на цепь ДНК. В какой-то неопределённый момент RecBCD распадается, хотя может расплести по крайней мере 60 тысяч пар оснований ДНК, оставаясь целым. RecA инициирует обмен нитями ДНК с идентичной или почти идентичной молекулой-матрицей; этот обмен создает структуру, известную как D-петля[англ.]. Образовавшаяся структура из двух ДНК-дуплексов с перекрещенными нитями может быть разрешена двумя способами: либо внедренная в матричную молекулу 3'-нить с Chi-сайтом послужит праймером для начала синтеза ДНК, либо произойдет расщепление D-петли с образованием структуры Холлидея. В свою очередь, структура Холлидея разрешается комплексом RuvABC[англ.] или посредством белка RecG. Каждое из этих событий ведет к появлению целой ДНК, которая отличается от родительских новыми комбинациями генов. Этот процесс, известный как гомологичная рекомбинация, завершает репарацию двухцепочечного разрыва[13].

Примечания

  1. ↑ 1 2 Smith G. R. How RecBCD enzyme and Chi promote DNA break repair and recombination: a molecular biologist's view. (англ.) // Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. — 2012. — Vol. 76, no. 2. — P. 217—228. — doi:10.1128/MMBR.05026-11. — PMID 22688812. [исправить]
  2. ↑ Spies M., Kowalczykowski S. C. Homologous recombination by RecBCD and RecF pathways // Bacterial Chromosomes (неопр.) / Higgins P.. — Washington, D.C: ASM Press[англ.], 2003. — С. 389—403. — ISBN 1-55581-232-5.
  3. ↑ Singleton M. R., Dillingham M. S., Gaudier M., Kowalczykowski S. C., Wigley D. B. Crystal structure of RecBCD enzyme reveals a machine for processing DNA breaks. (англ.) // Nature. — 2004. — Vol. 432, no. 7014. — P. 187—193. — doi:10.1038/nature02988. — PMID 15538360. [исправить]
  4. ↑ Bianco P. R., Brewer L. R., Corzett M., Balhorn R., Yeh Y., Kowalczykowski S. C., Baskin R. J. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. (англ.) // Nature. — 2001. — 18 January (vol. 409, no. 6818). — P. 374—378. — doi:10.1038/35053131. — PMID 11201750. [исправить]
  5. ↑ Amundsen S. K., Taylor A. F., Chaudhury A. M., Smith G. R. recD: the gene for an essential third subunit of exonuclease V. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1986. — August (vol. 83, no. 15). — P. 5558—5562. — doi:10.1073/pnas.83.15.5558. — PMID 3526335. [исправить]
  6. ↑ Yu M., Souaya J., Julin D. A. The 30-kDa C-terminal domain of the RecB protein is critical for the nuclease activity, but not the helicase activity, of the RecBCD enzyme from Escherichia coli. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1998. — 3 February (vol. 95, no. 3). — P. 981—986. — doi:10.1073/pnas.95.3.981. — PMID 9448271. [исправить]
  7. ↑ Taylor A. F., Smith G. R. RecBCD enzyme is a DNA helicase with fast and slow motors of opposite polarity. (англ.) // Nature. — 2003. — Vol. 423, no. 6942. — P. 889—893. — doi:10.1038/nature01674. — PMID 12815437. [исправить]
  8. ↑ Taylor A. F., Smith G. R. RecBCD enzyme is altered upon cutting DNA at a chi recombination hotspot. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1992. — 15 June (vol. 89, no. 12). — P. 5226—5230. — doi:10.1073/pnas.89.12.5226. — PMID 1535156. [исправить]
  9. ↑ Amundsen S. K., Taylor A. F., Reddy M., Smith G. R. Intersubunit signaling in RecBCD enzyme, a complex protein machine regulated by Chi hot spots. (англ.) // Genes & development. — 2007. — Vol. 21, no. 24. — P. 3296—3307. — doi:10.1101/gad.1605807. — PMID 18079176. [исправить]
  10. ↑ Taylor A., Smith G. R. Unwinding and rewinding of DNA by the RecBC enzyme. (англ.) // Cell. — 1980. — November (vol. 22, no. 2 Pt 2). — P. 447—457. — PMID 6256081. [исправить]
  11. ↑ Ретроны — важная часть врожденного иммунитета бактерий • Елена Наймарк • Новости науки на «Элементах» • Генетика, Микробиология. Дата обращения: 23 ноября 2020. Архивировано 23 ноября 2020 года.
  12. ↑ Taylor A. F., Schultz D. W., Ponticelli A. S., Smith G. R. RecBC enzyme nicking at Chi sites during DNA unwinding: location and orientation-dependence of the cutting. (англ.) // Cell. — 1985. — May (vol. 41, no. 1). — P. 153—163. — PMID 3888405. [исправить]
  13. ↑ 1 2 3 Anderson D. G., Kowalczykowski S. C. The translocating RecBCD enzyme stimulates recombination by directing RecA protein onto ssDNA in a chi-regulated manner. (англ.) // Cell. — 1997. — 11 July (vol. 90, no. 1). — P. 77—86. — PMID 9230304. [исправить]
  14. ↑ Taylor A. F., Smith G. R. Regulation of homologous recombination: Chi inactivates RecBCD enzyme by disassembly of the three subunits. (англ.) // Genes & Development. — 1999. — 1 April (vol. 13, no. 7). — P. 890—900. — PMID 10197988. [исправить]
  15. ↑ Dixon D. A., Kowalczykowski S. C. The recombination hotspot chi is a regulatory sequence that acts by attenuating the nuclease activity of the E. coli RecBCD enzyme. (англ.) // Cell. — 1993. — 9 April (vol. 73, no. 1). — P. 87—96. — PMID 8384931. [исправить]
  16. ↑ Spies M., Amitani I., Baskin R. J., Kowalczykowski S. C. RecBCD enzyme switches lead motor subunits in response to chi recognition. (англ.) // Cell. — 2007. — Vol. 131, no. 4. — P. 694—705. — doi:10.1016/j.cell.2007.09.023. — PMID 18022364. [исправить]
  17. ↑ Taylor A. F., Smith G. R. Strand specificity of nicking of DNA at Chi sites by RecBCD enzyme. Modulation by ATP and magnesium levels. (англ.) // The Journal Of Biological Chemistry. — 1995. — 13 October (vol. 270, no. 41). — P. 24459—24467. — PMID 7592661. [исправить]
  18. ↑ Anderson D. G., Kowalczykowski S. C. The recombination hot spot chi is a regulatory element that switches the polarity of DNA degradation by the RecBCD enzyme. (англ.) // Genes & Development. — 1997. — 1 March (vol. 11, no. 5). — P. 571—581. — PMID 9119222. [исправить]
  19. ↑ Amundsen S. K., Smith G. R. Chi hotspot activity in Escherichia coli without RecBCD exonuclease activity: implications for the mechanism of recombination. (англ.) // Genetics. — 2007. — January (vol. 175, no. 1). — P. 41—54. — doi:10.1534/genetics.106.065524. — PMID 17110484. [исправить]
  20. ↑ Köppen A., Krobitsch S., Thoms B., Wackernagel W. Interaction with the recombination hot spot chi in vivo converts the RecBCD enzyme of Escherichia coli into a chi-independent recombinase by inactivation of the RecD subunit. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1995. — 3 July (vol. 92, no. 14). — P. 6249—6253. — doi:10.1073/pnas.92.14.6249. — PMID 7541534. [исправить]
  21. ↑ Myers R. S., Kuzminov A., Stahl F. W. The recombination hot spot chi activates RecBCD recombination by converting Escherichia coli to a recD mutant phenocopy. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1995. — 3 July (vol. 92, no. 14). — P. 6244—6248. — doi:10.1073/pnas.92.14.6244. — PMID 7603978. [исправить]